作者：王红林 王治伦 陈静宏 吴劲 考希宾 高艳
【摘要】 目的 探讨p38 MAPK抑制剂SB203580对软骨细胞NFκB蛋白表达的影响。方法 体外培养兔关节软骨细胞，经甲苯胺兰染色鉴定后，一氧化氮(NO)供体NOC18和p38 MAPK抑制剂SB203580作用于细胞24h，用MTT比色法检测细胞增殖活性，Western blot测定NFκB p65亚单位蛋白表达水平。结果 与对照组比较，NOC18能抑制软骨细胞MTT增殖活性(P<0.05)；NOC18诱导的NFκB p65活性的升高被SB203580抑制(P<0.05)，而仅有SB203580作用于细胞时，与对照组比较，差别无统计学意义(P>0.05)。结论 p38 MAPK促进了NO诱导的兔关节软骨细胞NFκB的表达，NO致软骨细胞凋亡的信号通路中涉及了NFκB的活性表达。
【关键词】 NO；SB203580；软骨细胞；NF-κB
Effect of SB203580 on NFκB expression induced by nitric oxide in rabbit articular chondrocytes
ABSTRACT: Objective To explore the effect of p38 MAPK inhibitor SB203580 on chondrocyte protein expression of NFκB. Methods Rabbit articular chondrocytes were cultured in vitro, and identified using toluidine blue staining. Following treatment with nitric oxide (NO) donor NOC18 and p38 MAPK inhibitor SB203580 for 24h, we performed MTT assay to evaluate the proliferation of cells, and Western blotting to determine the protein expression of NFκB p65. Results NOC18 significantly reduced chondrocyte proliferation, compared with untreated controls (P<0.05); SB203580 was able to suppress the accelerated activity of NFκB p65 induced by NOC18 (P<0.05). However, there was no significant difference when treated only with SB203580, compared with the control (P>0.05). Conclusion The p38 MAPK promotes NOinduced rabbit articular chondrocyte NFκB expression, and the increase of NFκB expression is involved in NOinduced chondrocyte apoptosis pathway.
KEY WORDS: nitric oxide (NO); SB203580; chondrocyte; NFκB
软骨细胞在炎症刺激或外源性一氧化氮(nitric oxide, NO)供体如硝普钠(sodium nitroprusside, SNP)、亚硝基化合物(nitrosocompound, NOC)等作用下可产生大量NO[1]。越来越多的证据表明，NO与骨关节疾病的发病机制密切相关[23]，它能抑制软骨细胞增殖,诱导软骨细胞凋亡[45]。Kim等研究认为，p38丝裂原激活的蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase, MAPK)通路在NO诱导软骨细胞凋亡中发挥了重要作用，其机制可能为：NO激活p38，继而活化核因子κB(nuclear factor kappa B, NFκB)，再经由复杂通路最终导致软骨细胞发生凋亡[6]。另有研究报道，p38虽参与了IL1引起的软骨损伤，但p38 MAPK信号通路与IL1诱导的NFκB活性无关。因此，p38和NFκB是两条不同的引起软骨细胞损伤的通路[7]。本实验通过体外培养兔关节软骨细胞，研究p38 MAPK抑制剂SB203580对软骨细胞活性以及NFκB蛋白表达的影响，为了解软骨细胞凋亡发生的机制和指导骨关节疾病的治疗提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料 3周龄新西兰兔1只，重约0.5kg；Ⅱ型胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶(美国Sigma公司产品)；DME/F12细胞培养液(美国Hyclone公司)；胎牛血清(北京元亨圣马生物技术研究所)；甲苯胺兰(美国Amresco公司)；NOC18(德国Merck公司)；SB203580(美国Promega公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT)(华美生物工程公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；兔抗βactin抗体(美国Lab Vision公司)；兔抗NFκB p65抗体、辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗(美国Santa Cruz公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；ECL检测试剂盒(美国Pierce公司)。
1.2 关节软骨细胞的分离培养 无菌条件下分离兔关节软骨，用解剖刀将之切成约1mm3大小的碎块，分别采用透明质酸酶、胰蛋白酶和II型胶原酶分阶段消化,获得高成活率、成分均一的关节软骨细胞，接种于DME/F12培养基中，内含25%-30%的胎牛血清、105u/L青霉素、100mg/L链霉素，置入37℃、5%(体积分数)CO2培养箱中培养。倒置相差显微镜(Olympus)下观察细胞生长状况，隔天换液，原代细胞10d左右铺满单层，胰酶EDTA消化传代。根据实验设计，分别接种于培养瓶和24、96孔板，传代细胞7d左右融合成单层。所有实验均采用第一代软骨细胞以避免去分化的问题。
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